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一文了解293细胞转染流程

Dec 20th,2024 608 浏览量
293细胞转染是一种常用的细胞生物学技术,用于将外源DNARNA导入293细胞。这种方法广泛应用于研究基因表达、蛋白质功能以及药物筛选等领域。
中科百抗PolyToolTM 293转染试剂适合于HEK293细胞及其他HEK293细胞的高密度悬浮培养、DNA瞬时转染及蛋白表达。
(一)使用PolyToolTM 293转染293细胞流程
1.细胞接种(以25 mL体系为例)
根据细胞状态,选择合适的接种密度,建议 接种密度为1×106 cells/mL,待第二天细胞密度达到2×106 cells/mL左右,活性大于95%时进行转染。
2.瞬时转染
建议质粒(μg)与试剂(μL)参考配比区间为1:3~1:5之间。
1)使用本样品前涡旋混匀5秒,使用1.25 mLPolyToolTM 293 Medium稀释100 μL的转染试剂,并吹打均匀;
2)使用1.25 mL PolyToolTM 293 Medium稀释25 μg质粒,并吹打混匀;
3)将(1)和(2)所述溶液混合均匀;
4)将(3)所述混合溶液室温静置孵育10~15 min
5)将(4)中的复合物溶液加入25 mL的细胞培养体系中,放回摇床中,37 ℃、震荡速度120 rpm下继续培养。
3.产物表达与检测
1)转染24小时、72小时、120小时、168小时后加入3%293细胞蛋白表达补料B0.3%293细胞蛋白表达补料C
2)转染后第5~7天测定产物表达量。多数蛋白的合成在转染后第5天左右可达到最高值,客户可根据细胞状态及表达量选择适宜的收获时间。
(二)293细胞转染常见问题及解决方法
1.转染效率低
如果细胞转染效率偏低,则可能由以下原因造成:
1)细胞转染前结团或存活率低于95%
2DNA质粒纯度较低,或含有内毒素、蛋白质或其它影响细胞转染的物质;
3)需要调整DNA和转染试剂用量。
2.转染后细胞存活率降低
转染后细胞活率有所降低,属于正常现象,但转染5天后的细胞存活率一般仍可维持在70%以上。客户可根据细胞活率决定转染后的细胞培养天数,尽量在细胞活率降低至60%前收样。
3.转染后细胞结团
若转染后出现松散的细胞结团现象,可能是细胞成团粘附于瓶壁上并在震动中脱落下来所致,这种情况多数可能是摇瓶未清洗干净或细胞存活率低所引起。若转染后细胞结团现象比较严重,可在转染1天后加入抗结团剂。
4.表达量低
若出现蛋白表达量低,建议添加补料时可同时添加4 mML-Glutamine以及5 g/L的葡萄糖。
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