PolyTool™ 293-Fit Transfection Reagent Kit

1.材料准备（以25mL体系为例）：

试剂（PolyTool^TM 293 Transfection Reagent、PolyTool^TM 293 Medium、PolyTool^TM 293 B、PolyTool^TM 293 D、PolyTool^TM 293 Enhancer）

宿主细胞（例：HEK293，瞬转前1~2天接种，瞬转当天密度~2×10⁶cells/mL，倍增时间~30 h）

表达质粒（浓度1 μg/μL）

培养容器（例：125 mL摇瓶）

2.转染：

（1）细胞准备：建议接种密度为1×10⁶cells/mL，待第2天细胞密度达到2×10⁶cells/mL，活性大于95%时进行转染。细胞摇床设定为37°C，0% CO₂，120 rpm，80% RH（相对湿度）。

（2）复合：

①取1.25 mL PolyTool^TM 293 Medium（占最终表达体积的5%）稀释25 μg质粒DNA（单质粒系统质量为25 μg，双质粒系统总质量为25 μg），轻柔混匀；

②另取1.25 mL PolyTool^TM 293 Medium，加入125 μL PolyTool^TM 293 Transfection Reagent（确保总DNA与转染试剂的质量比为1:5），轻柔混匀；

③将转染试剂稀释液缓慢加入质粒稀释液中，立即轻柔混匀，室温孵育10 min使转染复合物充分形成。

（3）转染：从摇床中取出第1步接种好的HEK293细胞，加入孵育好的DNA/PolyTool^TM 293 Transfection Reagent复合物，完成转染。放回摇床继续培养。

（4）转染后18-24 h（Day1）：补料5 mL PolyTool^TM293 D（占最终表达体积的10%）、125 μL PolyTool^TM293 Enhancer（占最终表达体积的0.5%）和250 μL PolyTool^TM 293 B（占最终表达体积的1%），取样计数、测生化。

（5）转染后Day5-7：取样计数、测生化，收获上清（客户可根据细胞活率决定转染后的细胞培养天数，尽量在细胞活率降低至70%前收样）。