外周血单个核细胞分离液

血液样本中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其细胞密度为1.075～1.090g/ml，与其他细胞不同，红细胞和粒细胞等细胞密度较大，为1.090g/ml 左右，血小板为 1.030～1.035g/ml。因此，利用外周血单个核细胞分离液进行密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

取新鲜抗凝血1mL，与生理盐水或其他等渗溶液1：1混匀后，小心加于2mL的细胞分离液之液面上，以600～800g离心（水平转子）20~30分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。第一层为血浆层（含血小板），第二层为环状乳白色单个核细胞层（含单核细胞和淋巴细胞），第三层为透明分离液层，第四层为红细胞和粒细胞层。收集细胞放入含生理盐水或其他等渗溶液4~5mL的试管中，充分混匀后，以500g，离心20分钟。沉淀经反复洗2次即得所需细胞。

血液样本量2 mL，实验方法如下：

（1）取新鲜抗凝血2 mL，与生理盐水或其他等渗溶液1:1混匀。

（2）取一支15 mL离心管，加入3 mL外周血单个核细胞分离液，将稀释后血液小心缓慢加于分离液之液面上。

（3）使用高速冷冻离心机（Thermo，型号Sorvall ST 40R）400g离心30 min，升速1，降速0，离心温度20±2℃。

（4）小心吸取单个核细胞层到新的15 mL离心管中，加入3倍体积的生理盐水或其他等渗溶液（至少6 mL）混匀，室温250g，离心10 min，小心弃掉上清，去除残余血小板。

（5）加6~8 mL生理盐水或其他等渗溶液混匀，250g，离心10 min，小心弃掉上清，将会去除绝大部分血小板。

（6）将细胞用缓冲液或培养基重悬后进行检测、培养等后续操作。

280mOsmol/kg~340mOsmol/kg