一、背景
siRNA若要发挥RNAi作用，必须先逃离内体、进入胞质并与RISC结合。传统阳离子脂质体靠膜融合或打孔，剂量一高膜损伤就明显；且血清蛋白会中和表面电荷，复合物粒径增大，转染效率骤降。近五年，越来越多的实验室把视线转向阳离子聚合物——分支状PEI、可降解聚β-氨基酯、聚二硫等，利用“质子海绵”效应提高内体破裂率，兼顾低毒与血清耐受。
二、原理简述
阳离子聚合物与siRNA通过静电作用自组装成60–100 nm颗粒，经网格蛋白/小窝介导的内吞进入细胞。聚合物叔胺基团在pH 5.0–5.5的内体中大量捕获质子，伴随Cl-内流，渗透压升高，内体膨胀破裂，siRNA释放到胞质。由于聚合物骨架多含酯键或二硫键，48 h内可被水解或胞内GSH降解，电荷密度下降，毒性随之降低。
三、实验准备
siRNA：选择经HPLC纯化、Endotoxin <0.1 EU/μg的片段；浓度20–50 μM分装，避免反复冻融。
细胞：提前18–24 h接种，确保转染时融合度60–80%；原代细胞或悬浮细胞需用含2–5 % FBS的完全培养基维持状态。
对照：设置仅阳离子聚合物、non-targeting siRNA与target siRNA三组，以区分聚合物本身毒性及脱靶效应。
四、关键参数优化
N/P比：阳离子聚合物氮原子与siRNA磷酸根的摩尔比。PEI建议6–10，聚β-氨基酯8–15；比值过低包载不足，过高毒性上升。
剂量梯度：siRNA终浓度10–50 nM即可，原代细胞从5 nM起试，避免一次给足100 nM 导致细胞凋亡。
孵育时间：脂质体常需4–6 h换液，聚合物复合物可24 h后换液，减少原代细胞扰动。
六、常见问题与解决
1.沉默效率低：先查N/P比，再查细胞密度；若内体酸化弱，可加100 μM氯喹作阳性对照确认机制。
2.细胞死亡多：降低聚合物剂量或延长降解链段，改用聚二硫等可快速降解材料。
3.脱靶效应：把siRNA降至10 nM以下，同时使用2–3条独立序列验证表型。
阳离子聚合物通过“质子海绵”机制，提高siRNA内体逃逸率，可在含血清条件下实现 70–90%基因沉默，且细胞活率维持>90 %。实验成功的核心是控制N/P比、siRNA剂量和孵育时间，并设置严格对照。掌握上述要点，可在原代细胞、干细胞等难转染模型中获得稳定、可重复的RNAi数据。
