一、实验前准备
1.试剂：室温平衡密度1.077±0.001 g/mL的分离液（无菌、无沉淀），PBS（不含Ca²⁺/Mg²⁺），2% FBS-PBS洗涤液，台盼蓝。
2.耗材：15 mL离心管（无菌、无划痕），巴氏吸管，水平转子离心机（升降速均可调）。
3.样本：肝素或EDTA抗凝静脉血，4 h内处理。
二、标准分离步骤
1.取15 mL管，加入分离液3 mL，45°倾斜。
2.用吸管沿管壁缓慢叠加等量全血（3 mL），界面清晰无混层；血：分离液=1:1即可，血量不足时可补PBS稀释至原体积。
3.立即水平离心，400×g、20 ℃、30 min。
4.取出后可见四层：上层血浆、白膜状PBMC层、分离液层、粒细胞及红细胞沉淀。
5.吸管贴壁白膜层上方0.5 cm处，水平移动吸取全部白膜，转移至新管；一次吸尽，避免回吸。
6.加10 mL 2% FBS-PBS，轻轻吹打2次，300×g、10 min，弃上清。
7.重悬沉淀，再次加10 mL洗涤液，200×g、10 min；重复一次，共洗2次，彻底去除血小板和分离液。
8.末次弃上清后，用完全培养基或PBS重悬，台盼蓝拒染法计数，备用。
三、常见问题与解决
1.白膜层弥散：血液冷藏或离心升速过高导致；重新离心。
2.红细胞污染：分离液密度偏低或血量过多；检查密度，控制血：液≤1:1，可再铺一层分离液二次离心。
3.血小板过多：末次洗涤改用200×g、10 min，或加一次150×g、5 min低速洗涤。
4.细胞活力低：样本超4 h或PBS渗透压异常；采集后2 h内处理，使用新鲜2% FBS-PBS。
5.界面不清：抗凝剂不足或血液溶血；采血后立即颠倒混匀，避免剧烈震荡。
四、注意事项
- 全程18–25℃操作，避免低温引起血小板聚集。
- 吸管尖勿触碰分离液层，防止吸入粒细胞。
- 若后续做流式，第二次洗涤可用0.5 mM EDTA-PBS，减少结团。
- 分离液开封后4 ℃避光，一个月内用完，出现沉淀可37 ℃溶解后冷却至室温再使用。
