在免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）染色技术中，目标蛋白的精确定位与清晰显色是解读细胞和组织奥秘的窗口。然而，卓越的染色结果绝非仅依赖于优质的一抗二抗——贯穿全程的PBS缓冲液洗涤步骤，往往是被低估却决定成败的核心环节。规范的PBS洗涤能有效清除干扰、稳定反应环境，是获得高信噪比、低背景染色的基石保障。
一、为何洗涤如此关键？——清除干扰，守护特异性
免疫染色是一个多步骤、多试剂参与的精密过程，残留物是背景噪音与假阳性的主要来源：
1.清除未结合抗体：
一抗/二抗孵育后：大量未特异性结合的抗体残留在样本周围，如不彻底清除，将在后续步骤（尤其是显色/荧光信号放大系统）中非特异性结合，产生弥漫性背景染色（如图片“脏污”）。
2.中和与去除反应终止剂：
如酶标法IHC中使用的过氧化物酶阻断剂（如H₂O₂），残留会抑制后续显色反应。
3.稀释和移除阻断剂：
血清/BSA封闭液残留过多可能微弱结合二抗或显色底物，尤其当封闭血清与二抗种属不匹配时，易导致背景升高。
4.消除固定剂和通透剂残留：
甲醛、多聚甲醛残留影响抗原修复效果及抗体结合；Triton X-100、Tween-20等通透剂残留过量会破坏细胞膜结构或干扰抗体结合。
5.维持稳定的反应环境：
不同步骤间试剂pH、离子强度差异巨大（如抗原修复液pH可达9-10，显色液pH可能为5.5）。PBS洗涤能快速恢复中性生理环境（pH 7.2-7.4）和离子平衡，确保每一步反应（尤其酶促反应）在最佳条件下进行，防止pH波动导致的抗体变性、酶失活或异常沉淀。
二、PBS洗涤的科学规范：细节决定成像质量
仅“用PBS洗”远远不够，规范操作是保障效果的前提：
标准PBS (pH 7.4)：适用于大多数常规洗涤，提供稳定离子环境。
PBS-T(PBS+0.1% Tween 20)：微量去污剂Tween 20能显著降低表面张力，增强清洗效率，有效减少非特异性疏水结合，是降低背景的利器（尤其对胞内蛋白或膜蛋白染色）。
注意：Tween浓度过高（>0.3%）可能影响某些抗原表位或细胞形态。
2.洗涤体积与次数：
充分浸泡：确保样本完全浸没于洗涤液中。
高频次换液：关键步骤后（如一抗、二抗孵育后，显色/荧光标记前）需重复洗涤3次，每次5分钟。短暂浸泡或仅换液1-2次是背景升高的常见原因。
3.洗涤方式：
轻柔震荡：使用摇床进行轻柔水平震荡（约60 rpm），促进液体交换与残留物扩散，效果远优于静置洗涤。避免剧烈震荡导致组织脱落或切片损伤。
彻底吸弃：每次洗涤后务必彻底吸弃旧液（倾斜容器吸净边缘液体），防止残留液稀释新加入试剂。
4.温度控制：
室温（RT）洗涤即可满足绝大多数需求。特殊实验（如低温依赖性抗原）按方案执行。
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