一、污染物来源与危害
分子生物学下游的qPCR、测序、酶切对DNA/RNA纯度要求极高，但提取环节常引入三类污染物：①蛋白质残留，抑制Taq酶活性；②多糖、多酚，降低260/230比值，阻塞移液器；③有机溶剂（酚、乙醇）残留，导致荧光基线漂移。明确来源后，才能对症布控。
二、耗材与环境预控
耗材：枪头、离心管选用PCR级无DNA/RNA款，独立泡壳包装，拆封后一次性使用；每批次抽样做空白提取，确认无污染背景。
工作台：提前30 min用75%酒精+核酸清除剂擦拭，紫外线照射20 min；移液器主轴每月拆洗，防止气溶胶累积。
手套：丁腈手套优于乳胶，每换一步骤即更换，避免交叉污染。
三、样本前处理要点
血液：EDTA抗凝4 h内处理，防止基因组DNA裂解；若用肝素，需额外用肝素酶Ⅰ处理，否则下游PCR完全抑制。
组织：液氮研磨后按100 mg:1 mL比例迅速加入裂解液，65 ℃温育10 min，灭活内源RNase；脂肪含量高的组织，先加等体积PBS冲洗去脂。
细胞：胰酶消化后冷PBS洗两遍，彻底去除培养基中的血清与抗生素，避免酚/氯仿抽提时出现中间层乳化。
四、裂解与结合纯度提升
1.裂解液：经典GIT配方中β-巯基乙醇终浓度保持1%，既抑制RNase又不过度还原；对多糖植物样本，额外加入2% PVP-40，竞争性结合多酚。
2.蛋白酶K：55 ℃消化30 min即可，延长时间至过夜反而释放更多多糖；酶储存液分装–20℃，避免反复冻融导致自切产生蛋白碎片。
五、洗涤与去盐策略
膜干燥：开盖室温静置5 min，乙醇残留＜0.1%；膜过湿会稀释洗脱液，过干则降低得率，以膜表面无反光为度。
六、洗脱与保存
洗脱体积：50 μL是平衡点，体积过小得率低，过大浓度稀；65 ℃预热的EB缓冲液沿膜中央加入，静置2 min再离心，可提高10%得率。
保存：DNA–20 ℃短期，–80 ℃长期；RNA即刻逆转录，若需保存，加0.5 U/μL RNase inhibitor后–80 ℃，避免反复冻融。
七、常见问题速查
260/280偏低：蛋白质残留，增加蛋白酶K量或延长消化时间。
下游PCR抑制：乙醇或EDTA残留，再次65 ℃烘干5 min，重新洗脱。
