一、Wnt-3a为何成为分化“开关”
Wnt-3a是经典Wnt/β-catenin通路的核心配体，可维持多能干细胞自我更新，也能定向驱动神经、心肌、肠道等谱系分化。重组人Wnt-3a蛋白因无动物源成分、批间可控，已逐步替代条件培养基，成为实验室常规添加因子。
二、两种标签的设计初衷
1.His Tag版本：在蛋白C端引入6×His，便于镍柱一步纯化，终产品不含抗体片段，分子量小（≈38 kDa），接近天然序列。
2.hFc Tag版本：在C端融合人IgG1 Fc，通过Protein A柱纯化，分子量≈65 kDa；Fc段可二聚体化，提高局部浓度，并兼容Fc受体或二抗检测。
三、活性呈现方式
His Tag：需溶于含0.1% BSA的PBS中，以减缓吸附损失；工作浓度50–100 ng/mL即可激活报告基因，适合预算有限、需高通量筛选的实验。
hFc Tag：Fc融合使蛋白半衰期延长，培养基中2–3天补一次即可；工作浓度20–50 ng/mL，适合长时间定向分化，如心肌细胞30天方案。
四、操作差异
His Tag：
-对塑料管壁吸附强，储存液分装后–80℃冻存，避免反复冻融；使用时预冷管，先加培养基后加蛋白。
-无标签抗体可用抗His检测Western，IP需镍珠，与常规抗体无交叉。
hFc Tag：
-可直接用抗人IgG-Fc做Western、ELISA，无需额外抗体；IP用Protein A/G珠，背景低。
-若实验需去除Fc，可用凝血酶切位点预先设计，4℃酶切2 h后再过Protein A柱，流穿即为无标签Wnt-3a。
五、分化场景选择
神经前体诱导：His Tag更受欢迎，浓度梯度宽，便于做剂量依赖；且分子量小，不易在空间受限的3D基质中形成堵塞。
心肌分化：hFc Tag优势明显，Fc二聚体化可在细胞表面形成“配体簇”，mimic体内Wnt信号hotspots，减少每日换液次数。
肠道类器官：需长期维持50% Wnt-3a条件培养基，hFc Tag半衰期长，可隔日补液，降低培养成本。
六、常见问题与解决
1.背景高：hFc Tag被抗小鼠二抗识别，改用抗人Fc直标抗体即可。
2.活性低：His Tag溶液吸附损失，加入0.1% BSA或预包被低吸附管。
