即使培养基与血清质量都符合标准，细胞在RPMI 1640中依然可能出现生长不良。这时，应将关注点转向培养环境控制、日常操作细节以及细胞自身生物学状态。本文从三个方面解析问题成因，并提出针对性解决方案，帮助科研人员实现高质量的细胞培养。
一、培养环境的稳定性
1.CO₂浓度与pH控制
RPMI 1640依赖约5% CO₂维持pH 7.4。CO₂不足会使pH升高（培养液变紫），抑制代谢；过高则导致酸化（培养液偏黄）。
建议：定期校准培养箱气体传感器，确保CO₂稳定在设定值。
2.温度与湿度
-温度波动或未校准，会使细胞代谢紊乱。
-湿度不足导致培养液蒸发，加速渗透压变化。
解决：减少开关培养箱频率，在箱内放置无菌水盘维持湿度。
二、操作技术对细胞的影响
3.传代与消化
-作用不足导致细胞成团，营养分布不均。
优化建议：严格控制消化时间，结合显微镜观察状态结束消化。
4.离心与接种密度
-过高离心力或粗暴吹打会造成机械损伤。
-密度过低延缓进入指数生长期；过高则加速营养耗竭和酸化。
参数参考：离心力控制在1000–1200 rpm，时间约5分钟；密度依据细胞系设定合理范围。
三、细胞自身状态与特殊需求
5.代数与活力
-高代数细胞易出现衰老现象，增殖能力下降。
-冻存/复苏过程中的温度控制和操作不当会降低存活率。
建议：优先使用低代数细胞（<20代），优化冻存液配方和解冻过程。
6.支原体与隐性污染
支原体可长期隐匿存在，导致形态变化与生长缓慢。
检测方法：PCR或DAPI染色。发现污染应立即处理并更换相关材料。
7.特殊营养补充
可添加：GlutaMAX、丙酮酸钠（1 mM）、β-巯基乙醇（50 μM）、特定生长因子（如IL-2）
四、系统排查“四步法”
1.更换新鲜培养基与血清
2.校准环境参数
3.检测细胞状态与污染
4.对比不同条件的实验结果
