在细胞传代或原代分离过程中，胰酶消化是至关重要的一步。许多研究者忽略了PBS（磷酸盐缓冲液）预处理环节中钙（Ca²⁺）、镁（Mg²⁺）离子的关键作用，导致细胞解离效率低下、存活率下降。本文将基于细胞生物学机制，解析离子影响原理并提供科学的PBS选择策略。
一、钙镁离子：细胞粘附的“隐形锁”
细胞通过钙依赖黏附蛋白（如钙黏蛋白E-cadherin）和整合素（Integrin）锚定于细胞外基质（ECM），而Mg²⁺是整合素激活的关键辅因子。当PBS中含有Ca²⁺/Mg²⁺时：
·维持细胞间连接与基质附着
·稳定细胞膜结构完整性
·严重阻碍胰酶对细胞连接蛋白的切割效率
二、含离子PBS洗液的负面效应
1.消化效率低下
现象：消化时间延长（>10分钟），细胞仍成团、难以吹散。
机制：Ca²⁺/Mg²⁺竞争性占据胰酶活性位点，抑制其蛋白酶活性；同时离子维持细胞骨架张力拮抗酶解作用。
2.细胞损伤加剧
现象：解离后细胞碎片增多，台盼蓝拒染率下降（<85%）。
机制：延长消化时间导致膜蛋白过度水解，细胞膜完整性破坏。
3.解离结果不可控
现象：同批次细胞解离后状态差异大，影响后续实验重复性。
>典型误区：误将D-PBS（含Ca²⁺/Mg²⁺）当作通用缓冲液用于消化前清洗。
三、科学选择：无钙镁PBS（DPBS⁻/⁻）是解离成功的关键
▶ 核心解决方案：使用 DPBS⁻/⁻（Dulbecco’s PBS without Ca²⁺/Mg²⁺）
-作用机制：
-清除残留血清（含蛋白酶抑制剂）
-移除Ca²⁺/Mg²⁺，解除细胞粘连保护
-维持渗透压与pH（避免消化时细胞应激）
▶ 操作标准化流程：
1.弃去旧培养基
2.加入预温（37°C）DPBS⁻/⁻，轻摇清洗1-2次（完全去除血清）
3.吸净DPBS⁻/⁻
4.加入适量胰酶/EDTA消化液（0.25% Trypsin-EDTA）
5.显微镜下监控，细胞回缩变圆后立即终止消化
四、关键注意事项
1.EDTA协同增效原理：
-EDTA作为二价离子螯合剂，可结合微量残留Ca²⁺/Mg²⁺，增强胰酶活性。
-常规胰酶消化液已含0.02-0.53 mM EDTA，贴壁强细胞可额外补加。
2.避免过度清洗：
-DPBS⁻/⁻清洗＞2次或时间＞5分钟，可能导致细胞膜脂质流失。
3.溶液匹配性确认：
-确保所用DPBS⁻/⁻与消化液渗透压一致（~290 mOsm/kg）。
细胞解离不是简单的“浸泡-吹打”，而是对细胞微环境的精准调控。选择无钙镁PBS（DPBS⁻/⁻）预处理，通过消除Ca²⁺/Mg²⁺对胰酶的抑制作用，可显著提升解离效率与细胞存活率。牢记“无离子清洗→酶切松弛→温和终止”的操作逻辑，是获得高活性单细胞悬液的核心法则。
