1.充分脱蜡和水化：

60ºC脱蜡20min，再用二甲苯脱蜡两次，每次5-10min；用高浓度到低浓度梯度乙醇水化浸洗，以便后面的结合反应充分、均匀；

2.把握好细胞通透的时间：

一般根据切片的厚薄，选择蛋白酶k的孵育时间，通常孵育10-30min，注意几μm切片用短时间，几十μm切片用长时间。通过摸索达到既不脱片，又能够使后面的酶和抗体进入胞内。

3.适当延长TUNEL反应液的时间：

一般是37ºC反应1h，也可以根据凋亡损伤程度，选择更长的时间，可长至2h，但要结合最终的背景着色。

4.DAB显色条件的选择：

一般DAB反应10min左右，结合镜下控制背景颜色，最长不超过30min。

5.PBS的充分清洗：

在TUNEL反应后和酶标反应后的清洗应十分严格，可增加次数达5次，因为这些清洗直接决定最后切片的非特异性着色。

6.内源性POD的封闭：

该步骤非常关键，对于肝脏、肾脏等血细胞含量多的组织，适当延长封闭时间和升高过氧化氢的浓度，可以达到很好的封闭效果，且不影响最终的特异性染色。

7.细胞通透的时间选择

1)蛋白酶k的目的是通透细胞膜和核膜，从而使反应试剂充分进入细胞核进行反应，提高阳性率。但浓度过高或孵育时间太长容易脱片，只要不脱片，影响不大，其作用类似与TritonX100等细胞通透剂。

2)蛋白酶K一般工作液浓度为20μg/mL,但浓缩液可配制1-10 mg/mL，可用PBS配制，也可用蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris HCl pH8.0+50 mM EDTA）；然后分装成小份，用完一支再用下一支，-20ºC保存 1个月应该没问题的（重复拿的那支），而一直冷冻的至少可以用半年以上。

3)蛋白酶K反应时间一般为10-30min，具体时间长短与切片厚薄有关，4μm左右的片子可以反应10min，但30μm左右的可用30min，最终通过摸索最佳时间。过长易脱片、过短起不到通透效果。

关键试剂操作条件：DAB显色反应大约需要10min，要控制好反应时间，勿使背景颜色过深。具体的可能还是得根据切片组织来源和切片厚度、试剂盒种类不同来摸索一下；蛋白酶K工作液处理时间、温度须在范围内摸索，温度过高，时间过长，易破坏核酸结构，出现假阳性；DNase I=一般室温，10 min即可。

8.如何减弱非特异性染色？

若是肝脏或肾脏，因富含内源性过氧化物酶，需要增加过氧化氢浓度和延长孵育时间。其他还可以加强灭活、缩短DAB孵育时间、PBS充分清洗，注意镜下把握好着色。

Tips：

1.湿盒用带盖方盘，里面固定几根玻璃吸管用于放玻片，使用时稍加水即可。

2.英文说明书中对组织细胞通透这一步中，加了“对难处理的组织的处理”，意思是用常规方法处理（如蛋白酶K)后，应该阳性而做不出阳性时，可用微波修复。

3.复染的目的是为了衬托组织形态结构，以利于结果分析，石蜡切片常用苏木素，核染成兰色，冷冻切片常用甲基绿，核染成绿色。

4.PBS用蒸馏水、Na2HPO4、KH2PO4配制，加蒸馏水稀释后即可用。

5.蛋白酶K消化蛋白后，需要用封闭液。