在靶向基因沉默、药物筛选和功能基因组学研究中，高效、特异的siRNA转染是获得可靠数据的关键。然而，许多研究者面临共同困境：相同的siRNA序列和试剂方案，在不同细胞系中沉默效率天差地别——有些细胞沉默效果显著，另一些则毫无反应或伴随严重毒性！其核心挑战在于：不同细胞类型的内吞能力、内体逃逸效率以及对转染复合物的耐受性存在巨大差异。
一、为何优化“Ratio”对siRNA转染至关重要？
与DNA转染不同，siRNA需要在细胞质中释放并装载到RISC复合体上才能生效。转染试剂通过与带负电的siRNA结合形成纳米复合物，促进其被细胞摄取并逃离内体/溶酶体降解。
Ratio（通常表示为μL 试剂：nM siRNA或μg试剂：nM siRNA）失衡会导致：
1.试剂不足 (siRNA过量)：
·复合物带弱负电或中性，无法有效结合细胞膜，摄取效率低下。
·过量游离siRNA易被血清核酸酶降解，且可能诱发脱靶效应或免疫刺激。
2.试剂过量 (siRNA不足)：
·形成带强正电荷的大复合物，易聚集或与血清成分结合失活。
·高正电荷复合物对细胞膜破坏性强，毒性显著增加，导致细胞死亡或应激反应。
·即使进入细胞，过量试剂可能干扰内体逃逸或胞内转运，反而降低沉默效率。
3.内体逃逸失败：即使比例合适，但试剂本身内体逃逸能力差（常见于传统脂质体），大部分siRNA被困降解，无法发挥作用。
二、siRNA转染条件优化通用策略
1.确定细胞密度与状态（基础）：转染时细胞应处于“旺盛对数生长期”（通常60-80%汇合度）。密度过低（<40%）影响复合物结合；密度过高（>90%）导致接触抑制且试剂毒性易显现。推荐密度：60-80%（贴壁细胞）。
2.设定siRNA用量（起点）：针对靶基因设计高特异性siRNA（建议验证2-3条不同序列）。在24孔板中，常用20-100 nM终浓度作为起点（如100 μL体系加入1 μL 20 μM siRNA储存液即得20 nM终浓度）。难转染细胞或毒性敏感细胞可从更低浓度（如10-20 nM）开始。
3.优化Ratio(最关键)：
·起始点：优先查阅试剂说明书推荐的细胞特异性Ratio（若有）。如果没有，对于通用型非脂质体聚合物试剂（血清耐受型），一个常用起点是1 μL 试剂：20 nM siRNA (例如：20 nM siRNA 配1 μL试剂/24孔)。
·梯度测试：强烈建议对新细胞系或难转染细胞进行梯度测试。围绕起始点设置梯度Ratio（如：1:10，1:20，1:30，1:40 μL试剂：nM siRNA）。
稀释与混合：siRNA与试剂分别溶于无血清基础培养基（如Opti-MEM）或专用稀释液（血清耐受试剂可直接用完全培养基稀释）。体积通常各25-50 μL（24孔板），混合后室温孵育15-30分钟（形成复合物），再均匀加入含细胞的培养基中（血清耐受试剂无需换液！）。
4.评估指标（转染后24-72小时检测）：
·沉默效率(%)：qRT-PCR检测靶基因mRNA敲减水平（金标准），或Western Blot检测蛋白水平敲低（若抗体可靠）。理想沉默>70%。
·细胞活性(%)：使用CCK-8、MTT或台盼蓝染色法检测活细胞比例。理想状态是高敲低(>70%) +高活性（>85-90%）。
·非特异性效应：观察细胞形态，或用对照siRNA(Non-targeting siRNA)排除试剂毒性或非特异免疫激活（如细胞变圆、脱落、空泡化）。
