细胞传代是细胞培养实验中的核心环节，直接影响细胞活性、实验稳定性及后续研究结果。规范的传代操作不仅能维持细胞健康状态，还可避免污染风险，提升实验效率。本文从细胞培养逻辑出发，系统梳理细胞传代的关键注意事项。
一、传代前的准备工作
1.试剂与耗材预检
确保培养基、胰酶、PBS等试剂在有效期内，提前37℃水浴预热培养基至完全溶解。耗材需高压灭菌处理，超净台紫外照射30分钟以上。
2.细胞状态评估
显微镜下观察细胞密度达80%-90%时进行传代。贴壁细胞需呈现均匀单层，悬浮细胞应避免过度聚集。若发现异常颗粒或浑浊，立即终止传代。
二、标准化传代操作流程
1.消化时间精准控制
贴壁细胞使用0.25%胰酶消化时，37℃作用通常不超过3分钟。可轻拍培养瓶加速脱落，避免过度消化损伤细胞膜。
2.终止消化与离心参数
加入含血清培养基终止消化，离心转速建议设定为800-1000rpm，持续3-5分钟。离心后需彻底弃去上清，减少残留酶对细胞的毒性作用。
3.分瓶比例与接种密度
根据细胞类型调整分瓶比例：快速增殖细胞（如HEK293）按1:4传代，原代细胞建议1:2分瓶。接种密度需保证24小时内贴壁率达70%以上。
三、污染防控关键点
1.无菌操作强化
超净台内物品摆放遵循"清洁区-操作区-污染区"动线，镊子、移液器需定期酒精擦拭。每批次操作更换无菌手套。
2.支原体定期检测
每传代3-5代后使用PCR法或荧光染色法检测支原体污染。建议在培养基中添加2%浓度的双抗（青霉素-链霉素）进行预防。
四、传代后监测与记录
1.形态学跟踪
接种后6小时、24小时分别观察细胞贴壁情况，记录异常形态（如空泡化、颗粒增多）。悬浮细胞需重点监测聚团现象。
2.代谢指标分析
通过台盼蓝染色计算存活率（需＞95%），使用CCK-8法测定增殖曲线。建立传代日志，详细记录代次、密度、试剂批号等信息。
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